В арсенале специалистов в настоящее время есть разнообразные методы лабораторной диагностики, как классические, так и новейшие, появившиеся в последние десятилетия и нашедшие широкое применение в практике. Клиническая лабораторная диагностика является наиболее динамично развивающейся отраслью медицины, активно внедряющей и использующей современные научные достижения.
К основным методам лабораторной диагностики инфекционных заболеваний относятся иммунологические, микробиологические и молекулярно-генетические исследования, а также ряд новых методов.
Иммунологические методы применяются для определения неизвестных АГ с помощью известных АТ, содержащихся в иммунных диагностических сыворотках; а также для серологической диагностики – определения неизвестных АТ с помощью известного АГ–диагностикума. В настоящее время существует множество методик, в основе которых лежат указанные принципы. К наиболее известным и широко распространенным иммунологическим методам относятся: реакция агглютинации (РА), реакция непрямой (пассивной) агглютинации (РНГА/РПГА), реакция преципитации (РП), реакция иммуноэлектрофореза (РИЭФ), реакция связывания комплемента (РСК), реакция иммунофлюоресценции (РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА). Указанные методы давно применяются для диагностики инфекционных заболеваний и прочно вошли в медицинскую практику. В настоящее время на базе этих, уже ставших классическими, методов разработаны современные методики, такие как латекс-агглютинация, иммунохроматографические тесты, позволяющие быстро получать результаты. Достижением последнего десятилетия стало создание различных приборов, обеспечивающих автоматизацию процессов выполнения и анализа результатов исследований.
Преимуществами иммунологических методов лабораторной диагностики инфекционных заболевания являются: высокая скорость получения результатов, возможность оценки динамики инфекционного процесса, диагностики как острых, так и хронических инфекций, а также выявление инфекций, вызванных некультивируемыми и труднокультивируемыми микроорганизмами.
Однако данная группа методов не всегда обеспечивает высокую чувствительность и специфичность. Существует возможность диагностических ошибок в связи с наличием перекрестно-реагирующих АГ. Кроме того, иммунологические исследования, относящиеся к так называемым непрямым методам определения наличия возбудителей, не позволяют изучать инфекционные агенты и их свойства непосредственно (например, такие, как чувствительность к антимикробным средствам) и проводить сравнение микроорганизмов между собой, что необходимо для проведения эпидемиологических исследований, поиска источников, путей и факторов передачи инфекции.
Данная проблема решается применением микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, позволяющей выделять и идентифицировать возбудителей инфекционных заболеваний, оценивать их чувствительность к антибактериальным средствам, изучать различные биологические свойства и пр. В настоящее время именно микробиологические исследования являются «золотым стандартом» диагностики, так как относятся к методам прямого обнаружения возбудителей в клиническом материале и потому обладают высокой специфичностью.
Однако чувствительность микробиологических методов в большой степени зависит от целого ряда факторов, оказывающих влияние на ход и результаты исследования на преаналитическом, аналитическом и постаналитическом этапах диагностики. Прежде всего, это касается особенностей отбора проб, их транспортировки и хранения; наличия и доступности селективных питательных сред; видовых особенностей возбудителей; квалификации сотрудников, проводящих исследование. Кроме того, возможности микробиологической диагностики инфекционных заболеваний существенно ограничены в силу существования труднокультивируемых и некультивируемых микроорганизмов. Трудности культивирования могут быть обусловлены рядом причин, таких как требовательность микроорганизма к питательным средам и/или условиям культивирования (анаэробы, микроаэрофилы и др.), хронизация инфекционного процесса, применение в анамнезе или на момент обследования различных антимикробных средств и связанное с этим изменение биологических свойств возбудителя (переход в труднокультивируемое состояние) и др. Невозможность культивирования некоторых возбудителей (вирусов, хламидий и др.) в условиях обычной микробиологической лаборатории является ещё одним фактором, не позволяющим говорить о бактериологических исследованиях, как об универсальном методе диагностики инфекционных заболеваний. Кроме того, их проведение зачастую требует длительного времени, что делает невозможным проведение экспресс-диагностики и затрудняет использование результатов для своевременного назначения этиотропного лечения.
Необходимо отметить, что некоторые недостатки микробиологического метода компенсируются применением бактериологических анализаторов; специальных селективных, в том числе хромогенных питательных сред; экспресс-наборов, позволяющих быстро получать предварительные результаты или проводить идентификацию выделенных возбудителей и других современных технологий, позволяющих ускорить получение результатов и приблизить возможности микробиологической диагностики к ожиданиям врачей и пациентов.
В условиях интенсификации лечебно-диагностического процесса, роста значения вирусных инфекций, их удельного веса в структуре возбудителей при различной патологии и показателей заболеваемости, все большее внимание уделяется новым методам лабораторной диагностики, позволяющим оперативно получать результаты, использовать их для назначения и контроля качества лечения, выявлять различных, в том числе трудно- и некультивируемых возбудителей, проводить их видовую идентификацию, субвидовое типирование, оценивать чувствительность к антимикробным средствам.
Одним из новых методов лабораторной диагностики, призванным решить поставленные задачи в рутинной практике, является времяпролетная масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS) — спектральный метод изучения целых бактериальных клеток и их основных компонентов, основанный на измерении массы молекул или атомов, позволяющий проводить как прямое белковое профилирование для видовой идентификации микроорганизмов, так и обнаружение генетических маркеров лекарственной устойчивости. Преимуществами данного метода является высокая скорость видовой идентификации микроорганизмов (2-5 мин.), возможность автоматизации и роботизации всех стадий исследования, высокая специфичность. Однако, для проведения непосредственно самого исследования необходимо выделить чистую культуру микроорганизма при помощи микробиологических методов, что вносит ряд ограничений в применение MALDI-TOF MS, описанных выше. На качество идентификации влияет соблюдение всех этапов пробоподготовки, количество культуры и внутривидовая вариабельность отдельных микроорганизмов. Возможности определения чувствительности возбудителей к антимикробным препаратам при использовании масс-спектрометрии ограничены выявлением генетических маркеров и не позволяют выявить фенотипическую устойчивость, не обусловленную генотипическими изменениями, но зачастую играющую важную роль в неэффективности этиотропного лечения. Также к факторам, ограничивающим широкое применение данного метода в рутинной практике, можно отнести высокую стоимость масс-спектрометров.
Всё более востребованными становятся молекулярно-генетические методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), «BROAD-RANGE» ПЦР и анализ эволюционно-консервативных генов, секвенирование/пиросеквенирование, фрагментация генома и анализ спектра фрагментов, гибридизация на микрочипах, геномная гибридизация, геномная амплификация и секвенирование и др.
В настоящее время из молекулярно-генетических методов исследования наиболее широкое применение в диагностике инфекционных болезней нашла ПЦР, которая благодаря появлению доступных и удобных в использовании приборов завоевала прочное место в повседневной работе лабораторий. В основе ПЦР лежит искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro, с последующей детекцией продуктов амплификации при помощи различных методов. Одним из способов детекции, наиболее полно отвечающих задачам современной лабораторной диагностики, является детекция в режиме реального времени, являющаяся наиболее технологичным методом, позволяющим регистрировать появление и накопление ампликонов в закрытых пробирках, что исключает контакт продуктов ПЦР с окружающей средой и риск контаминации ампликонами; сократить время анализа; обеспечивает высокую надежность регистрации результатов и упрощает организацию лаборатории в целом.
Преимуществами ПЦР являются:
-прямое определение наличия возбудителей путем выявления специфического участка ДНК возбудителя (а не продуктов жизнедеятельности), что дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции;
-высокая специфичность, т. к. выявляется уникальный фрагмент ДНК, специфичный для данного возбудителя, и отсутствуют ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами;
-экстремальная чувствительность, обеспечиваемая выявлением даже единичных клеток возбудителей, что позволяет использовать ПЦР в тех случаях, когда другие методы диагностики не дают положительного результата;
-универсальность процедуры выявления различных возбудителей и возможность диагностики разных инфекций из одной биопробы;
-высокая скорость получения результатов анализа, т. к. не требуется выделение, выращивание возбудителя;
-возможность диагностики не только острых, но и вялотекущих, скрытых инфекций, выявления труднокультивируемых, некультивируемых, персистирующих форм микроорганизмов, внутриклеточных паразитов.
Наряду с преимуществами, молекулярно-генетические методы обладают рядом недостатков, таких как отсутствие выделения культуры возбудителя, что не позволяет изучать свойства микроорганизмов; невозможность выявления фенотипической устойчивости к антимикробным средствам (возможно выявление только генетических маркеров устойчивости); некоторые ограничения, связанные с наличием зарегистрированных тест-систем для выявления неполного спектра возбудителей инфекционных болезней.
Комментарии